Bereich: Grundlagenforschung Herzkreislauf

Dr. Marissa Jaconi Genf		Dr. Michel Pucéat Montpellier

Die Stammzellenforschung hat sich zu einem der grossen wissenschaftlichen Themen des frühen 21. Jahrhunderts entwickelt. Eines der spannendsten neuen therapeutischen Konzepte ist die Idee, in Folge bestimmter Krankheiten vernichtete Zellen durch in vitro gezüchtete, aus Stammzellen gewonnene Zellen zu ersetzen.

Dieser Vorgang hängt eindeutig vom Verständnis der Mechanismen ab, die die Zelldifferenzierung der embryonalen Stammzellen regulieren. Versteht man die Mechanismen zur Steuerung der Kardiogenese, ist man insbesondere in der Lage, gezielt die Differenzierung von Stammzellen in Herzzellen auszulösen, die für die Zelltherapie des erkrankten Herzens geeignet sind.

Die vor der Implantation von Embryonen im Blastozysten-Stadium isolierten Stammzellen haben die Fähigkeit, sich in praktisch alle im Körper vorkommenden Zelltypen zu differenzieren. Die Möglichkeit, embryonale Stammzellen von Knock-out-Mäusen zu gewinnen, bei denen ein bestimmtes Gen ausgeschaltet wurde, bietet daher die einzigartige Chance, die an der Kardiogenese beteiligten fundamentalen Gene zu studieren.

Zur in-vitro Differenzierung von embryonalen Stammzellen müssen normalerweise in einem ersten Aggregations-Schritt Strukturen geformt werden, so genannte embryoide Körper, die sich in eine grosse Zahl verschiedener spezialisierter Zellen differenzieren können, darunter die spontan zusammenziehenden Kardiomyozyten. Die Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus in Herzzellen innerhalb der embryoiden Körper stellt somit ein hochgradig reguliertes Kultursystem dar, in dem Genausdruck, myofibrillare Architektur und Zellfunktion analog zur Entwicklung des Herzens in vivo gesteuert werden.

Im Zuge der Anwendung dieses Differenzierungsmodells in vitro konnten wir darlegen, wie die für die Entwicklung des Herzens wichtigen Signalmoleküle / Transkriptionsfaktoren durch die intrazellulare Kalzium (Ca2+)-konzentration reguliert werden. Insbesondere untersuchten wir die Rolle der Kalzium transportierenden Proteine wie z.B. Calreticulin bei der Differenzierung der Kardiomyozyten. Tatsächlich ist Calreticulin ein multifunktionales Protein, das Ca2+ innerhalb der intrazellularen Zisternen bindet (nämlich im endoplasmatischen Reticulum) und dadurch zahlreiche Zellfunktionen beeinflusst, darunter die Regulierung der intrazellularen Ca2+-Homöostase. Nach der Zellaktivierung wird Ca2+ aus den Zisternen in die Zytoplasmen freigesetzt, und diese Erhöhung von Ca2+ wiederum reguliert diverse Zellfunktionen wie die Ionenkanalaktivität, die Aktivierung von Proteinen mittels Phosphorylierung und die Transkription von spezifischen Genen.

Es wurde bereits dargelegt, dass Calreticulin für die Kardiogene unerlässlich ist; Mäuse, die dieses Gen nicht haben, sterben vor der Geburt wegen schadhafter Entwicklung des Herzens. Zum Verständnis der diesem Defekt bei Knockout-Mäusen ohne Calreticulin zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen untersuchten wir die Differenzierung von embryonalen Stammzellen ohne Calreticulin in Herzzellen bei embryoiden Körpern. Die Zellen konnten nicht kontraktieren und wiesen eine gestörte Entwicklung der Myofibrillen auf, zurückzuführen auf eine verminderte Expression und Phosphorylierung der ventrikulären Myosin-Leichtkette 2, einem wichtigen Protein des kardialen Kontraktionsapparats. Durch Entfernung des extrazellularen Ca2+ oder chemische Hemmung des Ca2+-Anstiegs in der Zelle gelang es uns, einen ähnlichen Phänotypus in embryonalen Stammzellen mit Calreticulin zu reproduzieren, was darauf schliessen lässt, dass Ca2+ im frühen Stadium der kardialen Differenzierung eine grundlegende Rolle spielt.
Durch künstliche Herbeiführung eines intrazellularen Ca+2-Anstiegs konnten wir die Zellen ohne Calreticulin retten. Es ist unerlässlich, dass ein solcher Ca+2-Anstieg in einem sehr frühen Stadium stattfindet, damit die kardialen Transkriptionsfaktoren in den Zellkern eindringen können und die Gene für die kardialen kontraktilen Proteine aktivieren, wie z. B. die ventrikuläre Myosin-Leichtkette 2. Bei der Produktion muss dieses Protein mit einem Ca2+-abhängigen Enzym phosphoryliert werden, damit es richtig in die reifen Herzfasern eingeordnet wird. Diese Phosphorylierung fand bei den Zellen ohne Calreticulin nicht statt, konnte aber durch Herbeiführen eines Ca+2-Anstiegs zu einem frühen Zeitpunkt behoben werden.

Zusammenfassend ist zu sagen, dass unsere Arbeit zeigt, dass Calreticulin- und intrazellulare Ca2+-Signale in einem frühen Stadium der kardialen Differenzierung unerlässlich sind und bei der Ermöglichung Ca2+-abhängiger transkriptionaler Prozesse in der Entwicklung des Herzens eine wichtige Rolle spielen. Wir liefern den direkten Nachweis, dass Ca2+ bei der Kardiogenese von grundlegender Wichtigkeit ist; diese Aufgabe des intrazellularen Messengers war bisher noch nicht bekannt gewesen.

M. Jaconi, M. Pucéat, J. Li, K.-H. Krause, C. Perez-Terzic, A. Mery, M. Michalak, K. Nakamura
Calreticulin reveal a Ca2+ checkpoint in cardic myofibrillogenesis
J Cell Biol 2002, in press
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Die Forschungsarbeit
Calreticulin und Kalzium sind für die Kardiogenese unerlässlich	8 Kb