Bereich: Grundlagenforschung Infektiologie

Dr. Karl Perron Genf		Olivier Caille Genf		Dr. Thilo Köhler Genf

Beteiligung von CzcR-CzcS, einem Zweikomponentensystem, an der Resistenz gegenüber Schwermetallen und Carbapenem bei Pseudomonas aeruginosa

Zusammenfassung
Pseudomonas aeruginosa ist ein ubiqutär verbreitetes Bakterium, das sowohl im Boden, in Wasser als auch im Menschen vorkommen kann. Dieses unscheinbare Bakterium unserer Umwelt kann unter bestimmten Bedingungen zu einem gefährlichen Krankheitserreger werden und schwere Infektionen im Atmungsapparat und in den Harnwegen verursachen. Im Krankenhausbereich führt es insbesondere bei abwehrgeschwächten Patienten und an Mukoviszidose erkrankten Personen zu schwerwiegenden Problemen. Die geringe Durchlässigkeit seiner Zellmembran sowie zahlreiche Ausflusssysteme, die toxische Verbindungen ausscheiden können, verleihen P. aeruginosa eine starke natürliche Resistenz gegenüber Antibiotika und Schwermetallen.

Durch eines dieser Ausflusssysteme - als CzcCBA bezeichnet - kann P. aeruginosa Zink, Cadmium und Kobalt aus der Zelle ausstossen. Die Wirkung dieser Pumpe kann erheblich verstärkt werden, indem die Bakterien geringen Mengen an Schwermetallen ausgesetzt werden. Wir haben festgestellt, dass die Bakterien, sobald diese Pumpe durch Zink, Cadmium oder Kobalt induziert wurde, gegenüber Antibiotika der Carbapenem-Gruppe (Imipenem, Meropenem) resistent werden. Um den Mechanismus dieser beiden Resistenzarten zu verstehen, haben wir weitere Untersuchungen durchgeführt.

Bei P. aeruginosa beruht die Resistenz gegenüber Carbapenemen hauptsächlich auf Mutationen hinsichtlich der Expression des Porins OprD, der Eintrittspforte in die Zelle der basischen Aminosäuren, aber auch der Antibiotika der Carbapenem-Gruppe. Nach der Exposition der Zellen mit geringen Konzentrationen an Zink, Kobalt oder Cadmium ist das Protein OprD nicht mehr auffindbar, wodurch sich die festgestellte Resistenz gegenüber Imipenem erklären lässt.
Es stellt sich nun die Frage nach einem Mechanismus, der diese beiden Resistenzarten reguliert. Um eine Antwort darauf zu finden, wurden bei hohen Zinkkonzentrationen Spontanmutanten ausgewählt, die eine konstitutive Resistenz gegenüber Schwermetallen aufweisen. Alle analysierten Stämme besitzen eine zweifache Resistenz sowohl gegenüber Metallen als auch gegenüber Imipenem. Die quantitative RT-PCR-Analyse zeigt, dass diese Mutanten das Ausflusssystem CzcCBA verstärkt exprimieren und gleichzeitig, selbst wenn kein Zink vorhanden ist, hinsichtlich der Expression von OprD behindert sind. Anschliessend wurde der umgekehrte Versuch gemacht und nach imipenem-resistenten Mutanten gesucht. Dabei wurden zwei Mutantengruppen identifiziert. Die Mutanten der ersten Gruppe (80% der Stämme) sind ausschliesslich gegenüber Imipenem resistent, während die der zweiten Gruppe (20% der Stämme) sowohl gegenüber Imipenem als auch gegenüber Metallen resistent sind. Die Tatsache, dass die unabhängig in Bezug auf Zink oder Imipenem ausgewählten Mutanten eine Kreuzresistenz besitzen, ist ein Hinweis auf einen gemeinsamen Regulierungsmechanismus von OprD und CzcCBA.

Das Ausflusssystem CzcCBA ist einem Regulierungssystem mit zwei Komponenten untergeordnet, das aus einem Regulator (CzcR) und einem Sensor (CzcS) besteht, der auf hohe Metallkonzentrationen reagiert. Bei der quantitativen RT-PCR-Analyse lässt sich sowohl beim Ausflusssystem CzcCBA als auch beim Zweikomponentensystem CzcR-CzcS in Wildtypstämmen oder auf konstitutive Weise bei isolierten Mutanten nach einer Metallexposition eine starke Expression feststellen. Bei der Untersuchung durch Sequenzieren der Mutanten, die auf konstitutive Weise sowohl gegenüber Imipenem als auch gegenüber Metallen resistent sind, konnte eine Mutation festgestellt werden, die bei allen analysierten Mutanten identisch war. Diese Mutation liegt im Bereich des Proteins CzcS und scheint ihm einen permanent aktiven Zustand zu verleihen, was zu einer permanent verstärkten Expression des Ausflusssystems CzcCBA führt. Durch die verstärkte Expression des mutierten CzcS in einem sensiblen Wildtypstamm kann die Resistenz gegenüber Metallen und Imipenem induziert werden. Diese Ergebnisse legen also eine gekoppelte Regulierung zwischen dem Ausflusssystem der Schwermetalle und dem Einlasssystem von Imipenem nahe.

Zink ist ein Stoff, der bei der Fertigung von manchen Harnwegkathetern als Katalysator zum Einsatz kommt. Wir haben durch Messungen nachweisen können, dass das von diesen Kathetern in den Urin freigesetzte Zink in ausreichender Konzentration vorliegt, um die Resistenz von P. aeruginosa gegenüber Carbapenemen zu induzieren und konnten somit die wichtigen klinischen Aspekte dieser gekoppelten Regulierung entschlüsseln.

Bedeutung der Arbeit
Die Ergebnisse dieser Studie haben bedeutende Konsequenzen im Bereich der medizinischen Diagnose, der klinischen Pflege und der Gesundheitspolitik. Erstens kann durch diese gekoppelte Regulierung eine biologische Erklärung für die Wechselwirkung von Zink bei der Bestimmung der Resistenz gegenüber Imipenem bei P. aeruginosa gefunden werden. Zudem zeigen diese Versuche, dass das bei der Fertigung von bestimmten Harnwegkathetern aus Latex verwendete Zink in ausreichender Konzentration in den Urin abgeschieden wird, um die Resistenz gegenüber Imipenem zu induzieren und damit die Behandlung von Harnweginfektionen durch P. aeruginosa zu gefährden. Im Gegensatz dazu konnten im Urin aus PVC-Kathetern keine Zinkspuren nachgewiesen werden. Bei der Wahl der Harnwegkatheter muss also eine eventuelle Koloniebildung und Infektion durch P. aeruginosa berücksichtigt werden. Schliesslich lassen sich in einem zinkhaltigen Medium Spontanmutanten auffinden, die eine konstitutive Resistenz gegenüber Imipenem aufweisen. Das blosse Vorhandensein dieses Metalls - von bestimmten Kathetern abgegeben oder in einem kontaminierten Umfeld wie Böden und Flüssen vorhanden - könnte also Mutanten des P. aeruginosa induzieren, die selbst ohne jeglichen Kontakt mit diesem Antibiotikum gegenüber Imipenem resistent sind.

Perron K, Caille O, Rossier C, van Delden C, Dumas JL, Köhler T. J Biol Chem. CzcR-CzcS, a two-component system involved in heavy metal and carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa. 2004. 279: 8761-8768.
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Die Forschungsarbeit
Beteiligung von CzcR-CzcS, einem Zweikomponentensystem, an der Resistenz gegenüber Schwermetallen und Carbapenem bei Pseudomonas aeruginosa	11 Kb